Dominująca podobna do TH2 populacja T-Lymphocytów oskrzelowo-pęcherzykowych w astmie atopowej czesc 4

Komórki inkubowano jednocześnie z sondami interleukiny-4 lub 5 cRNA znakowanymi trifosforanem-biotyną urydyny (Universal Biological, London) i przeciwciałem monoklonalnym przeciwko CD3 bezpośrednio sprzężonym z izotiocyjanianem fluoresceiny (Becton Dickinson, Cowley, Wielka Brytania). Warunki hybrydyzacji in situ były takie, jak opisano uprzednio, 23 i pozytywną hybrydyzację mRNA sondy i cytokiny wykrywano przy użyciu barwienia streptawidyna-Teksas czerwony (Amersham). Kontrole stanowiły izotiocyjanian IgG1-fluoresceiny z sensownymi sondami lub wstępną obróbką RNazą. Komórki oznaczono ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a odsetek komórek wykazujących ekspresję mRNA CD3 i cytokiny, jak również procent pojedynczo wyznakowanych komórek oceniono przez zliczenie co najmniej 200 komórek dodatnich. Immunomagnetyczne rozdzielanie komórek
Aby dokładniej zbadać, czy komórki T były źródłem interleukiny-4 i 5 mRNA, komórki BAL od pięciu osobników z astmą inkubowano z perełkami immunomagnetycznymi (Dynabeads, Dynal, Wirral, Wielka Brytania) kowalencyjnie związanymi z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko CD2 w stosunku do trzy kulki do jednego limfocytu przez 20 minut w 4 ° C. Komórki oddzielono za pomocą separatora komórek magnetycznych (Dynal24). Komórki CD2-dodatnie przemywano czterokrotnie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z 0,1% albuminy surowicy bydlęcej i przygotowywano preparaty cytospinowe zarówno z komórek rozdzielonych dodatnio i ujemnie, jak iz nieseparowanych komórek dla zliczeń różnicowych i hybrydyzacji in situ dla interleukiny-4 i 5 mRNA. Hybrydyzację in situ mierzono pod względem liczby komórek z zachodzącymi na siebie ziarnami srebra jako procent całkowitej liczby komórek w preparatach cytokulbinowych komórek BAL w próbkach oddzielonych dodatnio lub ujemnie i nierozdzielonych. Wyniki te porównano z procentami limfocytów na szkiełkach cytospiny, co określono na maju – barwienie metodą Grünwalda-Giemsy.
Analiza statystyczna
Porównanie statystyczne zliczeń różnicowych BAL i wyników hybrydyzacji in situ przeprowadzono za pomocą testu U Manna-Whitneya z oprogramowaniem Minitab PC (Minitab, State College, Pa.).
Wyniki
Barwienie preparatem cytowirówki May-Grünwald-Giemsa wykazało wyższy procent eozynofilów w płynie BAL od osób z astmą (mediana, 3,6 procent) niż w płynie z kontroli (mediana, 0,4 procent, przedział ufności 95 procent dla różnicy, 0,7 procent do 5,5 procent, P <0,002). Niewielki, ale znaczący wzrost odsetka komórek tucznych zawierających błękit alcian został również zaobserwowany w płynie BAL u osób z astmą (0,3 procent w porównaniu z 0 procentami, 95 procent przedziału ufności dla różnicy, 0,1 procent do 0,3 procent; 0,002). Całkowita liczba komórek i odsetek innych typów komórek (makrofagi pęcherzykowe, limfocyty, neutrofile i komórki nabłonkowe) nie różniły się między obiema grupami.
Ryc. 1. Ryc. 1. Autoradiograf pokazujący sygnały z komórek BAL od osobnika z astmą hybrydyzowaną za pomocą antysensownego riboprobusa do interleukiny-5. Pozytywne sygnały pojawiają się jako gęste zbiory srebrnych ziaren pokrywających komórki (strzałki).
Figura 6. Figura 6. Autoradiograf pokazujący sygnały z komórek BAL od osobnika z astmą, hybrydyzowanego z antysensowną riboprobe do interleukiny-3
[przypisy: prywatne ubezpieczenie zdrowotne nfz, vibin mini ulotka, avamys ulotka ]