Dominująca podobna do TH2 populacja T-Lymphocytów oskrzelowo-pęcherzykowych w astmie atopowej cd

Preparaty inkubowano w 37 ° C, a następnie przechowywano w -80 ° C przed hybrydyzacją. Hybrydyzacja In Situ
Odczynniki i odczynniki do hybrydyzacji in situ były dostarczane przez Sigma, o ile nie podano inaczej. Wyznakowane radioaktywnie sondy RNA przygotowano tak, jak opisano uprzednio21. W skrócie, komplementarny DNA (cDNA) wstawiono do odpowiedniego wektora i linearyzowano w celu wytworzenia sond antysensownych (sekwencja komplementarna do mRNA cytokiny) i sensownych (identyczna sekwencja do mRNA cytokin). Znakowane transkrypty zsyntetyzowano w obecności trifosforanu adenozyny, trifosforanu guanozyny, trifosforanu cytydyny i znakowanego 32P trifosforanu urydyny (Amersham International, Amersham, Wielka Brytania) i polimerazy SP6 lub T7 (Promega Biotechnology, Southampton, Wielka Brytania) w celu wytworzenia antysensownego lub sondy sensowne. Skrawki BAL cytospiny ponownie uwodniono, a następnie komórki przepuszczono za pomocą Triton X-100 i proteinazy K. Następnie komórki utrwalono w 4% paraformaldehydzie, aby zakończyć aktywność proteiny K. Po przemyciu solą fizjologiczną buforowaną fosforanem, szkiełka zanurzono w 0,25% bezwodniku octowym i 0,1 mola trietanoloaminy na litr, a następnie prehybrydyzowano w 50% formamidzie i 2 × roztworze soli sodowo-cytrynianowej (SSC) (1 x SSC stanowiło 0,15 mola sodu; chlorek na litr, 0,15 mola cytrynianu sodu na litr, pH 7, BDH). Opisano niespecyficzne wiązanie sond cRNA do eozynofili22, ale uniknęliśmy tego w naszych preparatach poprzez zastosowanie czynników redukujących. Do hybrydyzacji zastosowano 10 .l buforu do hybrydyzacji zawierającego x 106 cpm znakowanej sondy RNA do każdego szkiełka. Skrawki następnie pokryto i inkubowano w 42 ° C przez 16 godzin. Po hybrydyzacji szkiełka płukano w malejących stężeniach SSC (od 4 x do 0,1 x) w 42 ° C. Niezhybrydyzowaną sondę RNA usunięto za pomocą 10 .g RNazy A na mililitr w 2 x SSC (15 minut w 37 ° C), a następnie szkiełka odwodniono alkoholami zawierającymi 0,3 procent octanu amonu przed suszeniem na powietrzu. Autoradiografię przeprowadzono przez zanurzenie preparatów w emulsji (K-5, Ilford, Moberley, Wielka Brytania) i wystawienie ich na trzy do pięciu dni przed opracowaniem (D-19, Kodak, Hemel Hempstead, Zjednoczone Królestwo).
Hybrydy między sondami mRNA cytokin i cRNA były zlokalizowane jako gęste kolekcje ziaren srebra nad komórkami. Ponieważ nie było możliwe zliczanie pojedynczych ziaren srebra, określiliśmy ilościowo komórki wyrażające mRNA cytokin pod względem liczby komórek z zachodzącymi na siebie ziarnami srebra na 1000 komórek w preparacie cytospiny. Co najmniej dwa szkiełka hybrydyzowano dla każdej sondy i zliczono trzykrotnie. Średni współczynnik zmienności dla liczby komórek wynosił 5 procent. Kontrolami ujemnymi były szkiełka cytosporyny hybrydyzowane z sondą sensowną i szkieletami wstępnie traktowanymi RNazą przed hybrydyzacją z sondą antysensowną. Pozytywne kontrole stanowiły szkiełka cytospinowe wytworzone z klonu komórek T o działaniu stymulującym konkanawalinę A, o których wiadomo, że wytwarzają interleukinę-3, 4 i 5 i GM-CSF lub ze stymulowanych fitohemaglutyniną komórek jednojądrzastych dla interleukiny-2 i interferonu gamma.
Jednoczesna identyfikacja mRNA CD3 i cytokiny
Aby zbadać, czy mRNA dla interleukiny-4 i 5 zostało wyrażone przez komórki T, preparaty cytotransfekcyjne komórek BAL od trzech osobników z astmą zostały utrwalone w 4% paraformaldehydzie i 15% sacharozie w roztworze soli buforowanej fosforanem.
[hasła pokrewne: usg nadgarstka warszawa, planowanie kariery zawodowej, gazpacho przepis oryginalny ]